Identifikasi Mikroba Metode Pewarnaan Gram

Identifikasi Mikroba Metode Pewarnaan Gram

Pembahasan kali ini saya akan membahas tentang pewarnaan Gram yang digunakan untuk mengetahui prinsip identifikasi mikroba metode pewarnaan Gram, mengetahui fungsi larutan dalam metode pewarnaan Gram, dan mengetahui fungsi pewarnaan Gram. Simak pembahasannya dibawah ini

Pengertian Pewarnaan Gram

      Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). Prinsip identifikasi mikroba metode pewarnaan Gram adalah mewarnai bakteri untuk mengetahui bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Tujuan pewarnaan Gram adalah untuk mengidentifikasi mikroba. Bakteri yang diwarnai dengan metode Gram ini dibagi menjadi dua kelompok yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Zat warna yang digunakan pada pengecatan Gram meliputi kristal violet, yodium, alkohol dan safranin. Fungsi pewarnaan Gram adalah untuk mengelompokkan dan mengidentifikasi bakteri berdasarkan komposisi dinding sel. Metode pewarnaan Gram termasuk pewarnaan diferensial.

Apa itu Bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif ?

       Bakteri Gram Positif adalah adalah bakteri yang dinding selnya menyerap warna violet dan memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal. Ciri – ciri bakteri Gram positif yaitu homogen dan tebal (20 -80 nm) sebagian besar tersusun dari peptidoglikan sebagian lagi terdiri dari polisakarida lain dan asam teikoat, bulat, batang atau filamen, bersifat lebih rentan terhadap penisilin, pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat – zat warna seperti ungu kristal. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang sederhana, dengan jumlah peptidoglikan yang banyak sehingga bereaksi positif terhadap pengecatan gram.Contoh bakteri Gram positif yaitu Actinomyces, Lactobacillus, Propionibacterium, Eubacterium dan Staphylococcus. 

        Bakteri Gram Negatif adalah bakteri yang dinding selnya menyerap warna merah, dan memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis. Lapisan peptidoglikan pada bakteri Gram negatif terletak di ruang periplasmik antara membran plasma dengan membran luar. Ciri - ciri bakteri gram negatif adalah memiliki dinding tidak terlalu tebal (peptidoglikan) yang mengandung asam tekoat, menghasilkan toksin bersifat endotoksin, dan tidak resisten terhadap pinisillin. Contoh bakteri Gram negatif yaitu Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, Azotobacter, Helicobacter pylori dan Haemophilus influenza.

Bagaimana Cara Melakukan Metode Pewarnaan Gram ?

       Sterilisasi meja kerja dengan menggunakan alkohol kemudian fiksasi kaca preparat. Ambil mikroba pada cawan petri yang telah di isolasi menggunakan ose bundar. Setelah itu goreskan koloni mikroba diatas kaca preparat, kemudian fiksasi dan tambahkan larutan Kristal violet sebanyak 2 tetes dan diamkan selama 1 menit. Setelah itu fiksasi dan bilas dengan aquades, tambahkan larutan iodine sebanyak 2 tetes dan diamkan selama 30 detik. Setelah itu bilas dengan aquades, lalu fiksasi dan tambahkan alkohol kemudian bilas kembali dengan aquades. Tambahkan larutan safranin sebanyak 2 tetes dan bilas dengan aquades. Setelah itu tempelkan kaca objektif diatas kaca preparat, kemudian diamati menggunakan mikroskop cahaya.

Kristal Violet

        Kristal violet adalah zat warna yang memberi warna ungu merupakan pewarna primer atau utama yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Senyawa penyusun dari kristal violet adalah dimethylaniline, oksiklorida dan asam klorida. Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Kristal violet bersifat basa mengandung ion positif sehingga mampu berikatan dengan sel bakteri yang bersifat asam (bakteri gram positif) yang membuat dinding sel bakteri yang mengandung asam nukleat (protoplasma) berikatan dengan ion positif kristal violet dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (Ungu).

Safranin

        Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder yang berwarna merah. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel - sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, memberikan warna pada mikroorganisme. warna ungu dalam sel bakteri Gram negatif memudar maka akan digantikan dengan warna safranin yang sebagai pengganti warna primer (warna ungu), bakteri Gram negatif akan menyerap safranin dan menggunakannya sebagai warna bakteri tersebut. Senyawa penyusunnya yaitu safranin o, etil alkohol, dan aquades. Sifat kimiawi yaitu safranin bersifat asam yang mengikat sel bakteri Gram negatif  yang bersifat basa. Karena dinding sel bakteri Gram negatif tersusun atas lipid yang tebal, saat diteteskan alkohol lapisan lipid akan larut sehingga pori–pori dinding selnya akan terbuka lebar dan warna ungu kristal violet akan keluar selanjutnya pada pemberian safranin dinding sel bakteri Gram negatif menyerap warna merah pada safranin. Sifat fisiknya yaitu berwarna merah, tidak berasa dan tidak berbau. Karena telah kehilangan warna ungu, bakteri Gram negatif akan berikatan dengan safranin dan berwarna merah. Tapi bakteri Gram positif tetap berwarna ungu karena warna safranin tidak dapat masuk, terhalang oleh adanya kompleks kristal violet-iodin.

Iodine

      Iodine merupakan zat yang digunakan dalam pewarnaan Gram, yaitu sebagai pewarna mordan. Pewarna mordan adalah pewarna yang berfungsi memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Sifat dari iodin yaitu tidak berbau, berwarna coklat, dan asam. Mekanisme kerjanya adalah iodine yang banyak dan  kompleks zat iodine terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme Gram positif  sedangkan lipid dari sel organisme Gram negatif dengan pencucian alkohol dapat hilang dari sel. Senyawa penyusun dari iodin adalah larutan kalii (kalium iodin) dan (iodium).

Alkohol

       Alkohol digunakan untuk membilas larutan zat pewarna primer. Alkohol bersifat asam basa dan tidak berwarna Solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu bakteri akan tetap berwarna ungu dan bakteri menjadi tidak berwarna. Mekanisme kerjanya adalah dekolorisasi yaitu ketika sel bakteri sudah menyerap atau melepaskan kristal violet (warna ungu) maka alkohol akan menghilakan warna yang tidak dibutuhkan oleh sel bakteri tersebut. Mekanisme dalam mengekstraksi lipid yang membuat permeabilitas dinding sel bakteri membesar dan menyebabkan warna sekunder (safranin) masuk dan terjebak diantara dinding sel dan lapisan membran sel bakteri Gram negatif. Alkohol bersifat merusak membran sel protein dari bakteri, sehingga terjadi denaturasi protein atau pengubahan struktur protein sehingga menjadi tidak aktif. Senyawa penyusun alkohol yaitu karbon, hidrogen, dan oksida.

Aquades

       Aquades berfungsi untuk membilas kristal violet, iodin dan safranin. Aquades bersifat basa, tidak berbau, dan tidak berwarna. Senyawa penyusun aquades yaitu hidrogen dan oksida. Aquades menghilangkan sisa zat-zat pewarna. Mekanisme kerjanya aquades akan menghilangkan sisa – sisa larutan pewarnaan Gram yang telah digunakan agar tidak dapat mempengaruhi hasil.

Fiksasi

      Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pembakaran. Fiksasi bertujuan untuk melekatkan bakteri diatas objek glass, membunuh mikroba secara tepat dengan tidak merusak struktur selnya, membuat sel lebih kuat, merubah afinitas cat, dan mencegah mengkerutnya globula – globula protein sel.

itulah tadi penjelasan dari saya, semoga bisa berguna dan bermanfaat buat kalian pembaca...

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro. 2005. Dasar-  Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.

Karmana. 2008. Biologi. PT. Grafindo Media Pratama. Jakarta.

Subandi,2012. Mikrobiologi. PT. Remaja Rosdakarya. Bandung.

Waluyo,L. 2005. Mikrobiologi Umum. MM Press. Malang.

ISOLASI MIKROBA

ISOLASI MIKROBA

Apa sih itu Isolasi ?
    Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel mikroba akan membentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya. Fungsi isolasi adalah menumbuhkan mikroba untuk mendapatkan biakan murni. Isolasi harus diketahui cara - cara menanam dan menumbuhkan mikroba pada medium biakan serta syarat - syarat lain untuk pertumbuhannya. Memindahkan bakteri dari medium lama kedalam medium yang baru diperlukan ketelitian dan pensterilan alat - alat yang digunakan, supaya dapat dihindari terjadinya kontaminasi. Pada pemindahan bakteri dicawan petri setelah agar baru, maka cawan petri tersebut harus dibalik, hal ini berfungsi untuk menghindari adanya tetesan air yang mungkin melekat pada dinding tutup cawan petri.Tujuan isolasi mikroba adalah untuk mengetahui jenis-jenis isolasi mikroba, untuk mengetahui agar miring dan agar tegak, dan untuk memahami penggunaan ose bundar dan ose tusuk. Cara yang digunakan ada dua yaitu :

A. Cawan Petri
        Media PCA dituang sebanyak ¾ dari tinggi cawan petri, kemudian tunggu hingga mengeras. Setelah itu mengambil mikroba dengan menggunakan ose bundar, kemudian gores secara zig – zag dan persegi. Setelah itu inkubasi didalam inkubator dengan suhu 36^oC.

B. Tabung Reaksi
        Media Na dituang kedalam dua tabung reaksi yang tegak dan miring, kemudian tunggu hingga mengeras. Setelah itu untuk agar tegak diisolasi dengan metode tusuk sedangkan untuk agar miring diisolasi dengan metode gores zig – zag. Kemudian masukkan kedalam inkubator untuk di inkubasi dengan suhu 36oC.

Pengenceran

       Pengenceran adalah mencampur larutan pekat (konsentrasi tinggi) dengan cara menambahkan pelarut agar diperoleh volume akhir yang lebih besar. Pengenceran ini bertujuan untuk mempermudah dalam perhitungan jumlah koloni mikroba yang tumbuh, baik warna maupun karakteristik lainnya. Hal ini sesuai dengan Ferdiaz (2001) yang menyatakan bahwa jumlah terbaik yang digunakan untuk perhitungan mikroba anatara 30 - 300 koloni. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal.

Larutan Fisiologis

       Larutan fisiologis adalah larutan yang digunakan untuk mengencerkan contoh pada analisis mikrobiologi. Pengenceran dilakukan untuk memperoleh contoh dengan jumlah mikroba terbaik untuk dapat dihitung yaitu antara 30 sampai 300 sel mikroba per ml. Pengenceran biasanya dilakukan 1:10, 1:100, 1:1000, dan seterusnya. Hal ini sesuai dengan Subandi (2012) yang menyatakan bahwa medium setengah padat yang memiliki konsistensi di antara medium cair dan medium padat. Larutan pengencer mengandung buffer untuk menjaga keseimbangan ion dari tubuh mikroba.

Metode Zig – Zag dan Persegi

        Proses isolasi metode streak plate, sampel bakteri akan dipindahkan ke media pertumbuhan baru dengan cara menggoreskannya di atas media pertumbuhan tersebut. cara memindahkannya menggunakan jarum ose bundar yang steril. Ada beberapa cara menggaris di proses isolasi metode streak plate, diantaranya adalah zig - zag streak dan quadrant streak. Fungsi metode zig - zag adalah agar mempermudah menentukan jumlah mikroba yang akan tumbuh di media. Fungsi metode persegi adalah agar mempermudah menentukan jumlah mikroba yang akan tumbuh di media tempat tumbuhnya mikroba terletak di antara garis - garis goresan dan sekitarannya. Penggunaan Zig - zag Streak Method dilakukan pada saat isolasi bakteri dari media pertumbuhan dengan jumlah bakteri yang hidup sedikit. Pemilihan ini didasarkan pada dua hal, yang pertama adalah jumlah bakteri yang hidup dan yang kedua adalah kesukaran dalam menggoresnya. Apabila jenis bakteri yang hidup pada media pertumbuhan memiliki jumlah yang sangat banyak, maka kalian bisa menggunakan Quadrant Streak Method atau persegi.



Agar Miring dan Agar Tegak

     Agar Miring adalah media agar pada tabung reaksi yang diletakkan miring pada waktu pendinginan. Agar miring ini merupakan salah satu cara yang mudah untuk kulturisasi mikroba, terutama yang bersifat aerobik atau anaerobik fakultatif. Fungsi agar miring adalah untuk menumbuhkan mikroba jenis aerob. Media agar miring, yaitu media agar padat dalam tabung reaksi yang diletakkan miring sehingga mempunyai permukaan media yang lebih luas daripada permukaan agar tegak, digunakan untuk menumbuhkan dan menyimpan biakan murni sebagai stock biakan murni (stock pure culture).
     Agar Tegak adalah media agar dalam tabung reaksi yang diletakkan tegak pada waktu pendinginan, digunakan untuk menstimulir pertumbuhan mikroba dalam keadaan kekurangan oksigen. Fungsi agar tegak untuk menumbuhkan mikroba jenis anaerob. Media agar tegak, yaitu media agar setengah padat dalam tabung reaksi, digunakan untuk menguji gerak bakteri secara makroskopis.



Apa Fungsi Ose tusuk dan Ose Bulat ?
       Fungsi ose tusuk adalah untuk menginokulasikan biakan mikroba ke media baru dengan cara memberikan tusukan pada lempeng agar hingga pada bagian tengah agar. Fungsi ose bulat adalah untuk menginokulasikan biakan mikroba dengan menggores permukaan agar dengan bentuk goresan tertentu.

DAFTAR PUSTAKA

Fardiaz, S. 2001. Mikrobiologi Pangan I. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Purwohadisantoso, 2008. Isolasi Bakteri Asam Laktat. Skripsi. Universitas Brawijaya. Malang.

Subandi, 2012. MikroBiologi. PT. Remaja Rosdakarya. Bandung

Waluyo, 2007. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang.

Perhitungan Jumlah Mikroba

Perhitungan Jumlah Mikroba

Apa yang dimaksud dengan Enumerasi ?

      Enumerasi mikroba adalah teknik perhitungan jumlah mikroba dalam suatu media tanpa mengidentifikasi jenis mikroba (bakteri, jamur, yeast). Teknik enumerasi mikroba ada dua yakni metode enumerasi mikroba secara langsung dan secara tidak langsung. Tujuan enumerasi adalah untuk mengetahui jumlah mikroba yang mungkin ada pada suatu bahan untuk pengawasan mutu pangan. Penetapan jumlah bakteri dilakukan dengan menghitung jumlah sel bakteri yang mampu membentuk koloni di dalam media biakan atau membentuk suspensi dalam larutan. Teknik enumerasi ada dua yaitu :

a. Enumerasi Secara Langsung

       Enumerasi mikroorganisme secara langsung merupakan cara perhitungan terhadap total dari jumlah sel mikroba dalm suatu sampel baik sel mati ataupun sel hidup. Enumerasi secara langsung dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu metode perhitungan dengan kamar hitung (Counting chamber),mikroskopis dan filter membran. Ruangan hitung (Counting chamber) adalah metode pengamatan langsung dengan kaca objek atau metode hitung dengan menggunakan haemocytometer. Mikroskopis adalah metode perhitungan mikroba dengan menggunakan mikroskop. Filter membran adalah perhitungan dengan menggunakan filter membran dengan menghitung jumlah sel rata-rata tiap kesatuan luas pada filter membran dapat dihitung jumlah sel dari volume suspensi yang disaring. Kelebihan metode ini adalah dapat menghitung jumlah mikroorganisme lebih cepat sedangkan kekurangan dari metode ini adalah mikroba yang mati dianggap seperti mikroba yang hidup, mikroba yang motil sulit dihitung dengan pasti, dan mikroba yang sedang dihitung perlu mencapai jumlah konsentrasi yang memadai untuk dihitung.

b. Enumerasi Secara Tidak Langsung

      Enumerasi secara tidak langsung merupakan perhitungan hanya kepada mikroba yang masih hidup sehingga hasilnya lebih akurat, memiliki metode yang dapat dilakukan antara lain dengan metode turbidometer, Total Plate Count (TPC) dan MPN method. Turbidometer adalah perhitungan jumlah bakteri berdasarkan kekeruhan dengan menggunakan alat turbidometer. TPC adalah suatu metode untuk menghitung jumlah mikroba yang hidup disuatu medium pada media. Prinsip TPC adalah pertumbuhan mikroba yang membentuk koloni dapat dianggap bahwa setiap koloni yang tumbuh berasal dari satu sel. MPN method adalah metode dengan melakukan pengenceran beberapa kali ulangan, secara matematik hasilnya dapat untuk menentukan kemungkinan besar jumlah mikroba yang terdapat dalam suspensi. Kelebihan dari metode ini adalah perhitungan hanya kepada mikroba yang masih hidup sehingga hasilnya lebih akurat sedangkan kekurangannya adalah membutuhkan waktu inkubasi yang lama sehingga hasilnya tidak didapat dengan waktu yang cepat.

Metode Total Plate Count (TPC)

       Metode Total Plate Count (TPC) merupakan suatu metode untuk menghitung jumlah mikroba yang hidup disuatu medium pada media. TPC termasuk enumerasi secara tidak langsung karena perhitungan hanya kepada mikroba yang masih hidup, sehingga mikroba akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata dan dihitung tanpa menggunakan mikroskop. Prinsip dari metode hitungan cawan atau Total Plate Count (TPC) adalah menumbuhkan sel mikroorganisme yang masih hidup pada media agar, sehingga mikroorganisme akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Standard Plate Count (SPC) merupakan suatu standar yang digunakan untuk melaporkan hasil analisis. Syarat–syarat SPC yaitu batasan mikroba yang memenuhi syarat 30≤ jumlah ≥300, dua koloni yang bertumpuk dihitung satu koloni, beberapa koloni yang berhubungan dihitung satu koloni, dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni, koloni yang terlalu besar atau lebih besar dari setengah cawan tidak dihitung, dan koloni yang besarnya kurang dari setengah cawan dihitung satu koloni. Kelebihan dari metode TPC yaitu dapat diketahui adanya mikroba jenis lain yang terdapat pada media dan dapat mengetahui jumlah mikroba yang dominan sedangkan kekurangan dari metode TPC adalah tidak menunjukkan jumlah sel yang sesuai karena ada beberapa sel yang berdekatan membentuk koloni dan menghasilkan jumlah yang berbeda.

Cara Perhitungan Jumlah Mikroba

       Cawan petri berisi inokulasi dibuat garis horizontal dan vertikal yang membagi cawan petri dengan menggunakan spidol. Kemudian dihitung jumlah mikroba yang mengacu pada standard plate count (SPC) yaitu 30≤ jumlah ≥300 koloni. Hasil jumlah koloni setiap kuadran percawan disubtitusikan ke rumus TPC dibawah ini untuk memudahkan hasil akhir perhitungan jumlah mikroba :

∑▒〖Sel=(∑▒〖  koloni〗)/cawan〗 x 1/fp x 1/(∑▒inokulum)

Keterangan:

∑▒sel : Jumlah sel (CFU/ml)

∑▒koloni : Jumlah koloni (CFU/ ml)

fp         : Faktor pengenceran

∑▒inokulum : Jumlah inokulum

Apa saja faktor-faktor yang mempengaruhi enumerasi ?

       Faktor yang mempengaruhi enumerasi pada metode ini yaitu kontaminasi, suhu, pH, faktor pengenceran dan teknik perataan. Kontaminasi bisa memengaruhi jumlah perhitungan jika kontaminasi seolah – olah menyerupai koloni yang ditumbuhkan padahal sebenarnya bukan koloni yang ditumbuhkan tapi terhitung sehingga terjadi kesalahan perhitungan. Suhu mempengaruhi jumlah mikroba karena jika suhu pemeraman tidak sesuai dengan suhu optimum suatu mikroba maka mikroba tidak bisa hidup dengan baik, berdasarkan suhu minimum, optimum dan maksimumnya bakteri dapat digolongkan menjadi tiga yaitu termofilik jenis bakteri yang  suhu optimum pertumbuhannya 45-60oC, jika spora bakteri tidak dapat bergerminasi dan tidak tumbuh di bawah suhu 50oC, bakteri tersebut disebut obligat termofil. Mesofilik jenis bakteri yang suhu optimum pertumbuhannya 30-37oC. Pisikofilik jenis bakteri yang suhu optimum pertumbuhannya 14-20oC, tetapi dapat tumbuh lambat pada suhu refrigerator (4oC). Suhu optimum khamir dan kapang 25–30oC. Nilai pH mempengaruhi jumlah mikroba karena jika pH yang didapat tidak sesuai maka mikroba tidak akan tumbuh dengan baik, Mikroorganisme juga memerlukan pH tertentu untuk pertumbuhannya, namun pada umumnya bakteri memiliki kisaran pH yang sempit, yaitu sekitar pH 6,5-7,5 atau pada pH netral, pH optimum pertumbuhan kapang yaitu 2-8 dan khamir yaitu 1,5-11. Faktor pengenceran, jika semakin tinggi tingkat pengenceran maka semakin sedikit mikroba yang tumbuh pada media, sedangkan semakin rendah tingkat pengencerannya maka semakin banyak mikroba yang tumbuh pada media sehingga nantinya tidak memenuhi syarat SPC yaitu 30≤ jumlah ≥300. Teknik perataan yang tidak merata akan menyebakan mikroba tidak bisa hidup atau tumbuh dengan baik sehingga akan memengaruhi jumlah perhitungan karena jumlah mikroba terlalu sedikit.

Apa itu TSUD (Terlalu Sedikit Untuk Dihitung) ?

      Perhitungan mikroba mempunyai batasan yaitu 30≤ jumlah ≥300. Terlalu  Sedikit  Untuk Dihitung (TSUD) merupakan  jumlah terkecil dari hasil koloni yang didapatkan  yaitu  <30 koloni yang ada pada  media  maka dari itu termasuk tidak  memenuhi  syarat yang ada. Jika jumlah koloni kurang dari 30 maka akan terjadi kesalahan  statistik  dan  kemungkinan munculnya kontaminan yang sangat tinggi dan dapat  mempengaruhi  produk pangan yang berarti  tidak  dapat dikonsumsi sedangkan pada hasil perhitungan maka akan terjadi human error saat perhitungan.  TSUD terjadi karena  disebabkan  oleh  pengenceran  yang besar  yang  menyebabkan  mikroba  menjadi satu koloni dan banyak media yang dipakai dan teknik perataan yang tidak merata akan menyebakan mikroba tidak bisa hidup atau tumbuh dengan baik.

Apa itu TBUD (Terlalu Banyak Untuk Dihitung) ?

        Batasan perhitungan mikroba yaitu 30≤ jumlah ≥300. Terlalu Banyak Untuk Dihitung (TBUD) merupakan jumlah terbesar dari hasil koloni yang didapatkan yaitu >300 koloni yang ada pada media sehingga masuk dalam syarat perhitungan jumlah mikroba. TBUD terjadi karena disebabkan oleh sedikitnya pengenceran sehingga jumlah mikroba banyak. Jika terjadi TBUD akan mengalami kerusakan dan human error saat perhitungan.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar - Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta

Fardiaz, S. 2001. Mikrobiologi Pangan I. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta

Hadioetomo, R. 1990. Mikrobiologi Dasar-Dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.

Pelczar, M. J, and E. C. S. Chan. 2008. Dasar - dasar mikrobiologi 2. Diterjemahkan oleh Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL. Universitas Hasanuddin. Jakarta

Volk. 1993. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Erlangga. Jakarta

Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Umum. MM Press. Malang.

Yudhabuntara. 2010. Mikroba dalam bahan pangan. Universitas Djuanda. Bogor

INOKULASI MIKROBA

INOKULASI MIKROBA

Pembahasan kali ini adalah tentang apa itu inokulasi, apa-apa saja teknik dalam melakukan inokulasi dan cara melakukan inokulasi. Sebelum melakukan inokulasi sebaiknya menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan yaitu cawan petri, tabung reaksi, hockey stick, tabung gas portable, bunsen, pipet volume, bulb,timbangan analitik, laminar air flow, vortex, erlenmeyer, sendok, inkubator dan rak tabung, aluminium foil, alkohol 70 %, kapas, tissue roll, kertas HVS dan label.

Pengertian Inokulasi

       Inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Media untuk membiakkan bakteri harus steril sebelum digunakan. Pencemaran terutama berasal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme.   Inokulasi berfungsi agar dapat diperoleh biakan mikroorganisme yang digunakan untuk pembelajaran mikrobiologi. Tujuan dilakukannya inokulasi adalah untuk memurnikan, mengidentifikasi dan menyimpan mikroba. Prinsip utama menginokulasi mikroba pada media padat adalah menumbuhkan mikroba tersebut dan mengamati karakteristik morfologinya. Pemindahan biakan mikroba yang dibiakkan harus sangat hati-hati dan mematuhi prosedur laboratorium agar tidak terjadi kontaminasi. Oleh karena itu, diperlukan teknik-teknik dalam pembiakan mikroorganisme yang disebut dengan teknik inokulasi biakan. Ada dua teknik yang digunakan untuk melakukan inokulasi yaitu :

a. Metode Pour Plate

       Pour Plate adalah teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar yang masih cair dengan stok kultur bakteri (agar) sehingga sel–sel tersebut tersebar merata dan diam baik di permukaan agar atau di dalam agar. Kelebihan metode ini adalah mikroba yang tumbuh tersebar merata pada seluruh media. Kelemahan metode ini adalah membutuhkan waktu yang lama dan media yang banyak.

      Cara melakukan inokulasi metode pour plate adalah Media PCA dituang kedalam cawan petri sebanyak ¼ dari cawan petri kemudian didinginkan. Suspensi 10^-5 dituangkan kedalam cawan petri dan diratakan. Media PCA di tuang sebanyak 2/4 kedalam cawan petri kemudian di dinginkan atau ditunggu mengeras. Setelah itu cawan petri di bungkus kertas dan dilakukan inkubasi dengan inkubator.

Gambar Metode Pour Plate

b. Metode Spread Plate

       Pour Plate adalah teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar yang masih cair dengan stok kultur bakteri (agar) sehingga sel–sel tersebut tersebar merata dan diam baik di permukaan agar atau di dalam agar. Kelebihan metode ini adalah mikroba yang tumbuh tersebar merata pada seluruh media. Kelemahan metode ini adalah membutuhkan waktu yang lama dan media yang banyak.

        Cara melakukan inokulasi metode spread plate adalah Media PCA dituang sebanyak 2/3 volume cawan petri. Lalu suspensi mikroba 10^-5 dipipet sebanyak 1 ml ke dalam cawan petri. Kemudian diratakan dengan hockey stick. Setelah itu diinkubasi dengan inkubator.

Gambar Metode Spread Plate

Inkubasi

      Setelah melakukan inokulasi media di inkubasi didalam inkubator. Tujuan dari inkubasi adalah agar mikroba yang telah diinokulasi pada media mendapat suhu optimum untuk tumbuh dengan baik sehingga nantinya didapatkan mikroba yang diinginkan. Alat yang digunakan pada saat inkubasi yaitu inkubator dengan mengatur suhu selama 7x24 jam. Suhu optimum pada mikroba yang terdapat di pisang yaitu 27–30o C.

Pembuatan Larutan Fisiologis

       NaCl ditimbang sebanyak 6,379 gram dengan timbangan analitik. Setelah itu NaCl dimasukkan erlenmeyer dan masukkan aquades sebanyak 750 ml. Kemudian dihomogenkan dan dipanaskan dengan hotplate. Lalu disterilkan dengan autoclave yang bertekanan 1 atm, menggunakan suhu 121˚C, dan waktu yang dibutuhkan selama ± 15 menit.

Pengenceran Bertingkat

      Siapkan larutan fisiologis, lalu ambil menggunakan pipet sebanyak 9 ml di dalam masing–masing tabung reaksi, kemudian masukkan bahan. Setelah itu timbang bahan sebanyak 1 gram atau 1 ml. Masukkan bahan kedalam tabung reaksi yang sudah ada larutan fisiologis, lalu dihomogenkan dengan vortex. Setelah itu diambil menggunakan pipet  sebanyak 1 ml dari setiap tabung reaksi, kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi yang kedua. Prosedur diulang sampai pengenceran 10^-5

DAFTAR PUSTAKA

Dwijosaputro. 1998. Dasar - dasar Mikrobiologi. Djambatan : Malang.

Fardiaz, S., 2001. Mikrobiologi Pangan I. Jakarta : Gramedia Pustaka Utama.

Hadioetomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : PT Gramedia Pustaka Utama.

Pelczar. J. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta : Universitas Indonesia.

Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Umum. Malang : MM Press.