Identifikasi Mikroba Metode Pewarnaan Gram

Identifikasi Mikroba Metode Pewarnaan Gram

Pembahasan kali ini saya akan membahas tentang pewarnaan Gram yang digunakan untuk mengetahui prinsip identifikasi mikroba metode pewarnaan Gram, mengetahui fungsi larutan dalam metode pewarnaan Gram, dan mengetahui fungsi pewarnaan Gram. Simak pembahasannya dibawah ini

Pengertian Pewarnaan Gram

      Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). Prinsip identifikasi mikroba metode pewarnaan Gram adalah mewarnai bakteri untuk mengetahui bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Tujuan pewarnaan Gram adalah untuk mengidentifikasi mikroba. Bakteri yang diwarnai dengan metode Gram ini dibagi menjadi dua kelompok yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Zat warna yang digunakan pada pengecatan Gram meliputi kristal violet, yodium, alkohol dan safranin. Fungsi pewarnaan Gram adalah untuk mengelompokkan dan mengidentifikasi bakteri berdasarkan komposisi dinding sel. Metode pewarnaan Gram termasuk pewarnaan diferensial.

Apa itu Bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif ?

       Bakteri Gram Positif adalah adalah bakteri yang dinding selnya menyerap warna violet dan memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal. Ciri – ciri bakteri Gram positif yaitu homogen dan tebal (20 -80 nm) sebagian besar tersusun dari peptidoglikan sebagian lagi terdiri dari polisakarida lain dan asam teikoat, bulat, batang atau filamen, bersifat lebih rentan terhadap penisilin, pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat – zat warna seperti ungu kristal. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang sederhana, dengan jumlah peptidoglikan yang banyak sehingga bereaksi positif terhadap pengecatan gram.Contoh bakteri Gram positif yaitu Actinomyces, Lactobacillus, Propionibacterium, Eubacterium dan Staphylococcus. 

        Bakteri Gram Negatif adalah bakteri yang dinding selnya menyerap warna merah, dan memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis. Lapisan peptidoglikan pada bakteri Gram negatif terletak di ruang periplasmik antara membran plasma dengan membran luar. Ciri - ciri bakteri gram negatif adalah memiliki dinding tidak terlalu tebal (peptidoglikan) yang mengandung asam tekoat, menghasilkan toksin bersifat endotoksin, dan tidak resisten terhadap pinisillin. Contoh bakteri Gram negatif yaitu Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, Azotobacter, Helicobacter pylori dan Haemophilus influenza.

Bagaimana Cara Melakukan Metode Pewarnaan Gram ?

       Sterilisasi meja kerja dengan menggunakan alkohol kemudian fiksasi kaca preparat. Ambil mikroba pada cawan petri yang telah di isolasi menggunakan ose bundar. Setelah itu goreskan koloni mikroba diatas kaca preparat, kemudian fiksasi dan tambahkan larutan Kristal violet sebanyak 2 tetes dan diamkan selama 1 menit. Setelah itu fiksasi dan bilas dengan aquades, tambahkan larutan iodine sebanyak 2 tetes dan diamkan selama 30 detik. Setelah itu bilas dengan aquades, lalu fiksasi dan tambahkan alkohol kemudian bilas kembali dengan aquades. Tambahkan larutan safranin sebanyak 2 tetes dan bilas dengan aquades. Setelah itu tempelkan kaca objektif diatas kaca preparat, kemudian diamati menggunakan mikroskop cahaya.

Kristal Violet

        Kristal violet adalah zat warna yang memberi warna ungu merupakan pewarna primer atau utama yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Senyawa penyusun dari kristal violet adalah dimethylaniline, oksiklorida dan asam klorida. Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Kristal violet bersifat basa mengandung ion positif sehingga mampu berikatan dengan sel bakteri yang bersifat asam (bakteri gram positif) yang membuat dinding sel bakteri yang mengandung asam nukleat (protoplasma) berikatan dengan ion positif kristal violet dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (Ungu).

Safranin

        Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder yang berwarna merah. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel - sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, memberikan warna pada mikroorganisme. warna ungu dalam sel bakteri Gram negatif memudar maka akan digantikan dengan warna safranin yang sebagai pengganti warna primer (warna ungu), bakteri Gram negatif akan menyerap safranin dan menggunakannya sebagai warna bakteri tersebut. Senyawa penyusunnya yaitu safranin o, etil alkohol, dan aquades. Sifat kimiawi yaitu safranin bersifat asam yang mengikat sel bakteri Gram negatif  yang bersifat basa. Karena dinding sel bakteri Gram negatif tersusun atas lipid yang tebal, saat diteteskan alkohol lapisan lipid akan larut sehingga pori–pori dinding selnya akan terbuka lebar dan warna ungu kristal violet akan keluar selanjutnya pada pemberian safranin dinding sel bakteri Gram negatif menyerap warna merah pada safranin. Sifat fisiknya yaitu berwarna merah, tidak berasa dan tidak berbau. Karena telah kehilangan warna ungu, bakteri Gram negatif akan berikatan dengan safranin dan berwarna merah. Tapi bakteri Gram positif tetap berwarna ungu karena warna safranin tidak dapat masuk, terhalang oleh adanya kompleks kristal violet-iodin.

Iodine

      Iodine merupakan zat yang digunakan dalam pewarnaan Gram, yaitu sebagai pewarna mordan. Pewarna mordan adalah pewarna yang berfungsi memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Sifat dari iodin yaitu tidak berbau, berwarna coklat, dan asam. Mekanisme kerjanya adalah iodine yang banyak dan  kompleks zat iodine terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme Gram positif  sedangkan lipid dari sel organisme Gram negatif dengan pencucian alkohol dapat hilang dari sel. Senyawa penyusun dari iodin adalah larutan kalii (kalium iodin) dan (iodium).

Alkohol

       Alkohol digunakan untuk membilas larutan zat pewarna primer. Alkohol bersifat asam basa dan tidak berwarna Solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu bakteri akan tetap berwarna ungu dan bakteri menjadi tidak berwarna. Mekanisme kerjanya adalah dekolorisasi yaitu ketika sel bakteri sudah menyerap atau melepaskan kristal violet (warna ungu) maka alkohol akan menghilakan warna yang tidak dibutuhkan oleh sel bakteri tersebut. Mekanisme dalam mengekstraksi lipid yang membuat permeabilitas dinding sel bakteri membesar dan menyebabkan warna sekunder (safranin) masuk dan terjebak diantara dinding sel dan lapisan membran sel bakteri Gram negatif. Alkohol bersifat merusak membran sel protein dari bakteri, sehingga terjadi denaturasi protein atau pengubahan struktur protein sehingga menjadi tidak aktif. Senyawa penyusun alkohol yaitu karbon, hidrogen, dan oksida.

Aquades

       Aquades berfungsi untuk membilas kristal violet, iodin dan safranin. Aquades bersifat basa, tidak berbau, dan tidak berwarna. Senyawa penyusun aquades yaitu hidrogen dan oksida. Aquades menghilangkan sisa zat-zat pewarna. Mekanisme kerjanya aquades akan menghilangkan sisa – sisa larutan pewarnaan Gram yang telah digunakan agar tidak dapat mempengaruhi hasil.

Fiksasi

      Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pembakaran. Fiksasi bertujuan untuk melekatkan bakteri diatas objek glass, membunuh mikroba secara tepat dengan tidak merusak struktur selnya, membuat sel lebih kuat, merubah afinitas cat, dan mencegah mengkerutnya globula – globula protein sel.

itulah tadi penjelasan dari saya, semoga bisa berguna dan bermanfaat buat kalian pembaca...

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro. 2005. Dasar-  Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.

Karmana. 2008. Biologi. PT. Grafindo Media Pratama. Jakarta.

Subandi,2012. Mikrobiologi. PT. Remaja Rosdakarya. Bandung.

Waluyo,L. 2005. Mikrobiologi Umum. MM Press. Malang.